Ein neuartiger Ansatz zur Entwicklung dreidimensionaler Blasentumormodelle für Arzneimitteltests

Erholung der Schweineblase

Die Entnahme tierischer Organe wurde gemäß den institutionellen Richtlinien durchgeführt, die vom Institutional Review Board der UBC (Vancouver, British Columbia, Kanada; A22-0119) genehmigt wurden. Insgesamt 3 Tiere wurden gemäß dem entsprechenden primären Forschungsprotokoll eingeschläfert und für die Experimente verwendet. Die Tiere wurden gemäß dem entsprechenden primären Forschungsprotokoll eingeschläfert. Unmittelbar nach dem Einschläfern des Schweins wurde die Bauchhöhle mit einem Schnitt in der Mittellinie geöffnet, die Blase identifiziert und entfernt. Die Blase wurde zur schnelleren Dezellularisierung in mehrere kleine Stücke (1 cm x 1 cm) geschnitten, die sofort in kalte PBS-Lösung gegeben wurden.

Dezellularisierung der Blase durch Eintauchen

Die Blasen wurden wie oben beschrieben gesammelt, die Stücke wurden in Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) (Fisher Scientific, 13.345.364, PA, USA) mit 50 nM Latrunculin B (Cayman Chemical, CAS 76343–94-7, Michigan, USA) getaucht und inkubiert für 120 Min. bei 37 °C. Nach der Inkubation wurden die Gewebe mit dH2O gewaschen und dann bei Raumtemperatur (RT) unter Rühren auf einem Schüttler 2 Stunden lang in sterile 0,6 M Kaliumchloridlösung (Fisher Scientific, AC424090010, PA, USA) getaucht. Die Gewebe wurden dann bei RT unter Rühren auf einem Schüttler für 2 Stunden in sterile 1 M Kaliumjodlösung (Sigma-Aldrich, 03.124, Darmstadt, Deutschland) getaucht, gefolgt von Eintauchen in steriles dH2O bei Raumtemperatur über Nacht. Die oben beschriebenen Schritte wurden als ein vollständiger Zyklus betrachtet. Jeder Zyklus wurde je nach Gewebegröße 10–12 Mal wiederholt, um eine ordnungsgemäße Dezellularisierung sicherzustellen. Schließlich wurden die Gewebe 120 Minuten lang in DNase I (1 kU/ml; Sigma-Aldrich, D4513, MO, USA) inkubiert und in dH gewaschen₂O für 2 Tage mit täglichem Wasserwechsel, um die restlichen Reagenzien zu entfernen. Dezellularisiertes Gewebe wurde für weitere Arbeiten bei -80 °C gelagert.

DNA-Quantifizierung

Sowohl natives als auch dezellularisiertes Gewebe wurden vor der DNA-Extraktion in 25-mg-Stücke geschnitten. Die kleinen Stücke wurden einzeln mit Proteinase K (QIAGEN, 19.133, Hilden, Deutschland) bei 56 °C und Rühren verdaut, bis sie vollständig lysiert waren. Die DNA wurde mit dem DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, 69.504, Hilden, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt. Anschließend wurden sowohl native als auch dezellularisierte Gewebe-DNA-Extrakte spektrophotometrisch mithilfe der NanoDrop-Technologie (Thermo Scientific, ND-2000, MA, USA) quantifiziert.

Rasterelektronenmikroskopie

Ein kleines Stück des nativen und dezellularisierten Blasengewebes wurde mit 4 % Paraformaldehyd (Electron Microscopy Sciences, 15.710, PA, USA) in 0,1 M PIPES (Sigma-Aldrich, P6757, Darmstadt, Deutschland) fixiert, gefolgt von einer zweiten Fixierung in 2,5 % Glutaraldehyd (Electron Microscopy Sciences, 16.020, PA, USA) in 0,1 M PIPES-Puffer bei RT. Anschließend wurde das Gewebe in 1 % Osmiumtetroxid (OsO4) (Electron Microscopy Sciences, 19.150, PA, USA) in 0,1 M PIPES-Puffer bei pH 6,8 und RT fixiert. Nach der Fixierung wurden die Gewebe mit doppelt destilliertem Wasser (ddH2O) gespült. Nach dem Spülen wurde die Probe bei Raumtemperatur durch eine abgestufte Ethanol-Wasser-Reihe dehydriert, gefolgt von drei Runden 100 % Ethanol (Electron Microscopy Sciences, 15.056, PA, USA). Kritische Punkttrocknung mit CO₂ (Tousimis Samdri®-795 Kritischer-Punkt-Trockner) wurde dann 1 Stunde lang angewendet, um eine vollständige Dehydrierung sicherzustellen, und die Probe wurde mit klebrigen Kohlenstoffbändern auf einem Aluminiumstummel befestigt. Abschließend wurde die Probe auf dem Stummel mit einer dünnen Schicht einer Au/Pd-Beschichtung (2 nm Dicke) unter Verwendung der Leica EM MED020-Beschichtung (Centre for High-Throughput Phenogenomics, UBC, Vancouver, Kanada) beschichtet. Die Bilder wurden mit einem Helios NanoLab 650 Focused Ion Beam SEM (Centre for High-Throughput Phenogenomics, UBC, Vancouver, Kanada) aufgenommen.

Zellkultur

Menschliche Harnblasen-Übergangszellkarzinome (UM-UC3) wurden in Minimal Essential Medium (MEM) (Gibco, 11.095.080), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) (Gibco, 12.483.020), kultiviert. Alle in dieser Studie verwendeten Medien wurden mit 1 % Antibiotikum-Antimykotikum (Gibco, 15,240–062, ON, Kanada) ergänzt, um eine Kontamination mit Bakterien und Pilzen zu verhindern. Alle verwendeten Zellen wurden bei 37 °C in 5 % CO kultiviert₂ Die Inkubator- und Mykoplasmenkontamination wurde in regelmäßigen Abständen für jede Zelllinie oder Primärzelle getestet. Wenn die Zellen konfluent waren, wurden sie durch Inkubation bei 37 °C für 3–4 Minuten mit 0,25 % Trypsin (Gibco, 25.200.056, ON, Kanada) passagiert, 5 Minuten bei 1.200 U/min zentrifugiert und im Medium resuspendiert. Die Zellen wurden langfristig in Bambanker (NIPPON Genetics, BB01, Düren, Deutschland) in einer Konzentration von einer Million Zellen pro ml und in flüssigem Stickstoff gelagert.

3D-Zellkultur (Sphäroide)

Die Zellen wurden trypsinisiert, gewaschen und zentrifugiert, um ein Pellet zu bilden. Das Pellet wurde dann in Matrigel (Corning, 354.234, ME, USA) resuspendiert, um Sphäroide mit einer Dichte von 1.000 Zellen pro μl Matrigel zu erzeugen. Ein 20-μl-Aliquot der Zellsuspension wurde in jede Vertiefung einer Platte mit 48 Vertiefungen ausplattiert. Die Platte wurde 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, damit sich das Matrigel verfestigen konnte. Nach der Verfestigung wurde das Kulturmedium vorsichtig zugegeben. Die Medien wurden mit 10 % konditioniertem R-Spondin1-Medium von Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293 T-Zellen (R&D Systems 3710-001-01) und 5 μM Y-27632 (Enzo, ALX-270–333-M001) ergänzt. . Die Sphäroide wurden vor Beginn der Behandlung fünf Tage lang in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 gehalten, wobei die Medien täglich gewechselt wurden.

Menschliches Blasenkrebsgewebe

Menschliches BCa-Gewebe wurde vom Vancouver General Hospital, Vancouver, BC, von 17 BCa-Patienten gewonnen. Alle Patienten gaben ihre Einverständniserklärung ab und diese Studie wurde vom Vorsitzenden des UBC Clinical Research Ethics Board genehmigt (Protokoll Nr. H19-00,814). Tumorgewebe wurde verwendet, um eine heterogene Zellpopulation zu sichern, die sowohl Krebszellen als auch andere Zelltypen wie Immun- und Stromazellen umfasst. Das Gewebe wurde dreimal mit sterilem PBS und 10 % Antibiotika-Antimykotikum (Ghibco, 15.240–062, ON, Kanada) gewaschen, dann mit einem Skalpell zerkleinert und mit Kollagenase A (Sigma Aldrich, 10.103.586.001) und Dispase II (Gibco, 17.105–) inkubiert. 041) für 2 Stunden bei 37 °C unter gelegentlichem Rühren. Danach wurden die Zellen durch ein 40-µm-Zellsieb filtriert. Die Zellen wurden mit sterilem 1X PBS gewaschen und dann 15 Minuten bei 37 °C mit TrypLE-Express-Enzym (Thermo Fisher, 12.605–028) inkubiert. Die Zellen wurden einmal mit 1X PBS gewaschen und 5 Minuten lang mit 1X Red Blood Cell (RBC) Lysis Buffer (ABCam, ab204733) inkubiert. Das Zellpellet wurde in einer Mischung aus REBM-Medien (Lonza, CC-3190), EBM-2 (Lonza, CC-3202) und DMEM-Medien (Gibco, 11.965.092) im Verhältnis 1:1:1 resuspendiert und dann bei 37 °C kultiviert in 5 % CO₂.

In-vitro-Modell für Blasenkrebs

Um das Krebsmodell zu erstellen, wurden zunächst dezellularisierte Blasen mit einer Stanzbiopsie in Stücke mit einem Durchmesser von 5 mm geschnitten und auf Zellkultureinsätze (Fisher Scientific, 08–771, PA, USA) gelegt. Anschließend wurden diese Einsätze in 6-Well-Einsätze platziert Platten (Corning, CL-S3516, ME, USA) zur Schaffung einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche. Die Muscularis propria der Blase wurde teilweise entfernt, um das Stroma für die Rezellularisierung freizulegen. Insgesamt 1,5 × 10⁶ UM-UC3-Zellen oder BCa-Patientenzellen wurden zu drei verschiedenen Zeitpunkten (Tag 0, 3 und 5) in die dezellularisierte Schweineblase injiziert. Die Gewebe wurden weitere 9 Tage lang mit entsprechenden Wachstumsmedien (3 ml pro Vertiefung) bei 37 °C und 5 % CO inkubiert₂. Die Medien wurden jeden zweiten Tag gegen neue Medien ausgetauscht. Am 14. Tag wurden die rezellularisierten Gewebe in 10 % Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet, und es wurden 5 μm dicke Schnitte für H&E- und immunhistochemische (IHC)-Bewertungen erhalten.

Lebensfähigkeitstest

Die Zellen wurden in 96-Well-Platten mit 4000 Zellen/Well bei 37 °C und 5 % CO2 ausgesät. Nach 24 Stunden wurden unterschiedliche Konzentrationen an Arzneimitteln (Cisplatin (Cis), Gemcitabin (Gem) und eine Kombination) hinzugefügt und das Medium allein wurde als Kontrolle verwendet. Die Zellen wurden 72 Stunden lang in Behandlungsmedien inkubiert. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit MTS-Reagenz (Sigma-Aldrich, MO, USA) in 200 μl frischem Medium (Verhältnis 1:20) gemessen, das bei 37 °C in 5 % CO2 inkubiert wurde, und die Plattenablesungen wurden nach 60 Minuten bei 490 nm durchgeführt (BioTek, VT, USA). Für jedes Experiment gab es drei technische Wiederholungen.

Lumineszenztest

Die Zelllebensfähigkeit der Sphäroide wurde anhand der Lumineszenz am Tag 0 (Vorbehandlung) und am Tag 6 (Nachbehandlung) nach Zugabe von jeweils 50 µL CellTiter-Glo® 3D Cell Viability Assay (Promega, Madison, WI, G9681) bewertet Also. Die Platten wurden dann 5 Minuten lang auf einem Schüttler geschüttelt und weitere 25 Minuten lang auf einer Schaukelplattform bei Raumtemperatur inkubiert, bevor die Lumineszenz mit einem Tecan Infinite M200 Luminometer gemessen wurde. Alle Tests wurden dreifach durchgeführt und Standardabweichungen wurden angegeben.

Histologie

Alle Gewebe wurden über Nacht in neutral gepuffertem Formalin (10 % Formalin) (Fisher Scientific, 22–046-361, PA, USA) fixiert und dann vor der Paraffineinbettung in 70 % Ethanol überführt. Formalinfixierte, in Paraffin eingebettete Proben wurden in 5 μm dicke Schnitte geschnitten und auf Glasobjektträger gelegt (Fisher Scientific, 12–550-15, USA). Nachdem die Gewebe entparaffiniert und dehydriert worden waren, wurden die Objektträger 3–5 Minuten lang mit destilliertem Wasser, Hämatoxylinlösung, Gill Nr. 2 (Sigma Aldrich, GHS232, Darmstadt, Deutschland) gewaschen und mit Leitungswasser gespült, gefolgt vom Eintauchen in Shandon-Bläuungsreagenz ( Thermo Fisher, 6,769,001, MA, USA) für 30 s. Die Schnitte wurden erneut in Leitungswasser gespült und 30 s lang mit Eosin Y-Lösung (Millipore Sigma, 1.098.441.000, Darmstadt, Deutschland) gefärbt. Wir haben apoptotische Zellen des Tumormodells mit einer TUNEL-Färbung nachgewiesen. Nach dem Entparaffinieren und Dehydrieren wurden die Paraffinschnitte mit einem TUNEL-Assay-Kit (Abcam, ab206386, Cambridge, MA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers gefärbt. Zur Ki-67-Markierung wurden die Schnitte mit dem monoklonalen Ki-67-Antikörper 1:1000 (eBioscience™13–5698-82) gefärbt. Alle Deckgläser wurden mit CitosealTM XYL (Thermo Fisher Scientific, 8312–4) montiert. Anschließend wurden die Objektträger mit einem Aperio Digital Whole Slide Scanner (Leica Biosystems) gescannt.

Medikamentöse Behandlung

Die Arzneimittel wurden auf der Grundlage der aktuellen Anwendung in der Klinik für die BCa-Behandlung Cis (Cisplatin-Injektion 100 mg/100 ml, Teva Standard) und Gem (Gemcitabin-Injektion 2 g/52,6 m) ausgewählt. Für diese Studie wurden beide Medikamente vom BC Cancer Hospital, Vancouver, British Columbia, Kanada, als Spende erhalten.

Genetische Validierung

Ein robustes präklinisches Modellsystem muss die genetische Heterogenität von Tumoren widerspiegeln, um eine optimale Behandlung zu ermöglichen. Das heißt, es sollte die genetischen Veränderungen des Primärtumors beibehalten. Um die genetische Stabilität von Organoidlinien in Kultur sowie in orthotopen Xenotransplantaten und von Xenotransplantaten abgeleiteten Organoiden zu beurteilen, wird typischerweise eine Tiefensequenzierung durchgeführt, um ihre Mutationsprofile zu vergleichen⁴². Um genetische Veränderungen in unserem aus Patientenzellen abgeleiteten 3D-Blasenkrebsmodell zu bewerten, isolierten wir DNA an den Tagen 7, 14 und 21. Vor der Erstellung der DNA-Bibliothek wurden Gewebeproben mit dem Covaris M220 auf eine mittlere Zielinsertgröße von 200 bp fragmentiert Fokussierter Ultraschall. Sequenzierungsbibliotheken wurden aus 50 oder 100 ng fragmentierter Input-DNA unter Verwendung des KAPA HyperPrep-Kits und IDT xGen CS-Adaptern erstellt. Die Bibliotheken wurden gepoolt und zu einem benutzerdefinierten KAPA HyperDesign-Target-Capture-Panel hybridisiert, das 60 mit Blasenkrebs assoziierte Gene und 3000 gleichmäßig verteilte SNPs umfasst. Die Sequenzierung wurde auf dem Illumina NovaSeq 6000 unter Verwendung eines 2 × 150 bp S4-Kits durchgeführt. Die Analyse wurde mit zuvor veröffentlichten benutzerdefinierten internen Bioinformatik-Tools durchgeführt²¹. Für aus nicht fixierten Zellen extrahierte DNA waren für das Calling somatischer Varianten mindestens 5 unterstützende Lesevorgänge und ein VAF von mindestens 1 % erforderlich. Für von FFPE abgeleitete Proben wurden 8 unterstützende Lesevorgänge und 5 % VAF verwendet.

Statistische Analyse

Wir haben statistische Analysen mit der Prism GraphPad-Software Version 8 durchgeführt. Wir haben den Schülertest verwendet, um zwei Variablen zu vergleichen. Für Mehrfachvergleiche wurden einfaktorielle ANOVAs verwendet, gefolgt von Bonferroni-Post-hoc-Tests oder einer 2-faktoriellen ANOVA beim Vergleich mehrerer experimenteller Gruppen. Quantitative Daten wurden, sofern relevant, als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. P-Werte von